在高等植物中,叶片中的叶绿体主要进行光合作作用,为植物的生长发育供给能量。当叶片中的叶绿体发育受阻、叶绿体结构和叶绿素含量发生变化,叶片会出现异常叶色的突变表型,进而影响产量。在水稻中,叶色突变体的发掘为叶绿体合成和降解,以及叶绿体发育相关的分子机制研究提供宝贵材料,同时也为杂交制种、观赏稻育种和生产实践提供了更多种质资源。本研究中,我们通过EMS诱变粳稻品种武运粳7号（WYJ7）获得了两个水稻叶色相关突变体叶片早衰突变体（early senescence 2,es2）和温敏型白绿叶突变体（white green leaf 5,wgl5）,并对两个突变体的表型和遗传进行了分析,对ES2基因和WGL5基因进行图位克隆,研究结果如下:1、早衰叶ES2基因:（1）表型分析:es2突变体从苗期到成熟期均显示叶片衰老。在苗期出现黄斑,之后叶片逐渐枯萎。此外,与野生型相比,es2突变体株高,节间长度、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数和1000粒重极显著下降,而分蘖数显著增加。（2）生理指标测定:叶绿素含量和光合速率测定显示,es2突变体在苗期、分蘖期和抽穗期的叶绿素含量较野生型显著减少,分蘖期的光合速率显著下降。NBT和DAB染色表明,es2突变体中积累了大量活性氧（ROS）和H2O2。es2突变体的H2O2和MDA含量显著升高,SOD、POD和APX活性也显著提高,而CAT的活性显著降低。TUNEL实验显示,es2突变体细胞中大量DNA片段发生断裂。（3）透射电镜观察分析:es2突变体透射电镜结果显示叶绿体基质层结构无序排列,并且存在大量嗜饿颗粒,导致叶绿体发育异常。（4）qRT-PCR分析:es2突变体中与衰老、ROS、叶绿素降解相关基因的表达量显著上调,而与叶绿素合成、光合作用和叶绿体发育相关基因的表达量显著下调。（5）遗传分析和基因定位:遗传分析显示,es2突变体由隐性核基因控制。精细定位将该基因定位在水稻第2染色体ID2-3和ID2-4两个分子标记之间约116.7 kb的物理区间。对该区间的基因组测序发现,在LOC＿Os02g32370基因的编码区内发生了单碱基突变,由G突变为A,导致编码产物肌醇多磷酸激酶的甘氨酸替换为谷氨酸（Gly→Glu）。（6）互补和过表达验证:互补和过表达ES2基因,转基因植株均恢复到野生型表型,对叶绿素和光合参数测定发现,也恢复到了野生型水平。（7）亚细胞定位:激光共聚焦显微镜检测结果显示,p35S::ES2-GFP融合蛋白与叶绿体自发荧光共定位,ES2蛋白亚细胞定位在细胞核和细胞质中。（8）ES2基因表达模式分析:通过对各转基因植株GUS染色分析,在根、茎、叶、鞘和穗中均有表达,qRT-PCR结果表明,叶中的表达水平最高,其次是茎、穗、根和鞘。2、温敏型白绿叶WGL5基因:（1）表型分析:wgl5突变体在苗期和分蘖期出现白绿叶表型,抽穗期开始主要表现为植株最下部叶片出现白绿叶,而其他部位表现为持绿表型,分蘖期叶绿素含量差异极显著,光合速率降低。（2）温度处理分析:在25℃条件下,wgl5突变体的表型与野生型WYJ7无差异,突变体在35℃高温情况下,wgl5突变体表现为白化叶,叶绿素含量较野生型显著下降。在35℃条件下,透射电镜观察野生型和wgl5突变体的叶片叶绿体发现,野生型WYJ7的叶绿体发育良好,具有致密的基粒片层结构,而wgl5突变体的叶绿体发育受损。（3）分蘖期生理分析:wgl5突变体透射电镜结果显示叶绿体基质层结构无序排列,并且存在大量嗜饿颗粒,导致叶绿体发育异常。NBT和DAB染色表明,wgl5突变体中积累了大量O2-和H2O2。TUNEL分析还显示,wgl5细胞中出现了大量DNA断裂,导致叶片发生细胞凋亡。（4）遗传和基因定位:遗传分析显示,wgl5突变体由隐性核基因控制。精细定位将该基因定位在第5染色体区域ZL-8和RM440两个标记之间,其物理距离为51.72 kb。测序发现在LOC＿Os05g33840基因的编码区上发生单碱基突变,G变成A,该突变导致氨基酸序列中的甘氨酸变成丝氨酸（Gly→Ser）。（5）互补和过表达验证:LOC＿Os05g33840基因互补和过表达转基因植株均恢复到野生型水平,qRT-PCR分析显示,互补转基因植株表达量恢复到野生型WYJ7的表型,而过表达植物表达量差异极显著。并且对叶绿素进行测定,发现均恢复到野生型WYJ7表型。（6）亚细胞定位:激光共聚焦显微镜检测结果显示,p35S::WGL5-GFP融合蛋白与叶绿体自发荧光共定位,将WGL5蛋白亚细胞定位在叶绿体中。（7）WGL5基因表达模式分析:通过对各转基因植株GUS染色分析,在根、茎、叶、鞘和穗中均有表达,qRT-PCR结果表明,叶中的表达水平最高,其次是茎、鞘、根和穗。
基本信息
| 题目 | 水稻早衰叶ES2和温敏型白绿叶WGL5基因克隆与功能分析 |
| 文献类型 | 博士论文 |
| 作者 | 杨生龙 |
| 作者单位 | 沈阳农业大学 |
| 导师 | 钱前,徐正进 |
| 文献来源 | 沈阳农业大学 |
| 发表年份 | 2020 |
| 学科分类 | 农业科技 |
| 专业分类 | 农作物 |
| 分类号 | S511 |
| 关键词 | 水稻,叶色,早衰,白绿叶 |
| 总页数： | 128 |
| 文件大小： | 9359k |
论文目录
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物叶绿体的起源与进化 |
| 1.2 植物叶绿体的结构与功能 |
| 1.3 植物叶绿素的合成与降解 |
| 1.3.1 植物叶绿素的合成途径 |
| 1.3.2 植物叶绿素的降解途径 |
| 1.4 .水稻叶色突变体的来源 |
| 1.4.1 自然突变 |
| 1.4.2 人工诱变 |
| 1.4.3 插入突变 |
| 1.5 水稻叶色突变体的类型 |
| 1.6 水稻叶色突变体的遗传特性 |
| 1.7 水稻叶色突变体分子机制及研究进展 |
| 1.7.1 水稻叶绿素生物合成、降解途径调控叶色相关基因 |
| 1.7.2 水稻叶绿体发育调控叶色相关基因 |
| 1.7.3 水稻核-质信号途径调控叶色相关基因 |
| 1.8 水稻衰老突变体的研究进展 |
| 1.8.1 叶绿体降解相关基因调控水稻叶片衰老 |
| 1.8.2 植物激素相关基因调控水稻叶片衰老 |
| 1.8.3 转录因子相关基因调控水稻叶片衰老 |
| 1.8.4 能量代谢途径相关基因调控水稻叶片衰老 |
| 1.8.5 谷氨酸合酶Fd-GOGAT基因调控水稻叶片衰老 |
| 1.8.6 其他基因调控水稻叶片衰老 |
| 1.9 本研究的目的与意义 |
| 第二章 水稻早衰叶ES2基因克隆与功能分析 |
| 2.1 研究材料与相关试剂与仪器 |
| 2.1.1 早衰突变体材料es2的来源 |
| 2.1.2 遗传群体的构建和田间管理 |
| 2.1.3 常用试剂与仪器 |
| 2.1.3.1 实验试剂 |
| 2.1.3.2 常用仪器设备 |
| 2.1.3.3 相关载体及菌株 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 EMS诱变 |
| 2.2.2 农艺性状调查 |
| 2.2.3 叶绿素含量测定 |
| 2.2.4 光合速率测定 |
| 2.2.5 透射电镜观察 |
| 2.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 NBT和 DAB染色 |
| 2.2.8 生理指标测定 |
| 2.2.8.1 H2O2含量测定 |
| 2.2.8.2 过氧化氢酶（CAT）活性测定 |
| 2.2.8.3 丙二醛含量（MDA）测定 |
| 2.2.8.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 |
| 2.2.8.5 过氧化物酶（POD）活性测定 |
| 2.2.8.6 抗坏血酸氧化酶（APX）活性测定 |
| 2.2.9 遗传分析与基因定位 |
| 2.2.10 DNA的提取 |
| 2.2.11 RNA的提取 |
| 2.2.12 RNA反转和q RT-PCR |
| 2.2.13 PCR扩增体系及琼脂糖电泳检测 |
| 2.2.14 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.15 PCR扩增片段回收 |
| 2.2.16 相关载体的构建 |
| 2.2.17 大肠杆菌感受态DH5α的制备 |
| 2.2.18 大肠杆菌热激转化 |
| 2.2.19 大肠杆菌质粒提取 |
| 2.2.20 农杆菌感受态EH105的制备 |
| 2.2.21 农杆菌电击转化 |
| 2.2.22 农杆菌介导水稻成熟胚的转化 |
| 2.2.23 水稻原生质体的提取与转化 |
| 2.2.24 农杆菌侵染烟草的体内瞬时表达法 |
| 2.2.25 GUS染色 |
| 2.2.26 蛋白序列比对和系统发育分析 |
| 2.2.27 RNA-Seq分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 es2突变体表型和农艺性状分析 |
| 2.3.2 es2突变体叶绿素和光合速率的测定 |
| 2.3.3 es2突变体透射电镜观察 |
| 2.3.4 es2 突变体叶片NBT和 DAB染色 |
| 2.3.5 es2突变体生理指标测定 |
| 2.3.6 es2突变体细胞凋亡分析 |
| 2.3.7 es2突变体中相关基因的表达量分析 |
| 2.3.8 RNA-Seq分析 |
| 2.3.9 es2突变体遗传分析和图位克隆 |
| 2.3.10 es2突变体候选基因预测及测序分析 |
| 2.3.11 ES2蛋白序列比对和系统发育分析 |
| 2.3.12 ES2基因的转基因互补验证 |
| 2.3.13 ES2基因的转基因过表达验证 |
| 2.3.14 ES2蛋白的亚细胞定位 |
| 2.3.15 ES2表达模式分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 水稻温敏型白绿叶WGL5基因克隆与功能分析 |
| 3.1 研究材料与相关试剂与仪器 |
| 3.1.1 白绿叶突变体wgl5的来源 |
| 3.1.2 遗传群体的构建和田间管理 |
| 3.1.3 常用试剂与仪器 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 化学诱变 |
| 3.2.2 叶绿素含量测定 |
| 3.2.3 光合速率测定 |
| 3.2.4 透射电镜观察 |
| 3.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 3.2.6 NBT和 DAB染色 |
| 3.2.7 遗传分析与基因定位 |
| 3.2.8 DNA的提取 |
| 3.2.9 RNA的提取 |
| 3.2.10 RNA反转和q RT-PCR |
| 3.2.11 PCR扩增体系及琼脂糖电泳检测 |
| 3.2.12 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.13 PCR扩增片段回收 |
| 3.2.14 相关载体的构建 |
| 3.2.15 大肠杆菌感受态DH5a的制备 |
| 3.2.16 大肠杆菌热激转化 |
| 3.2.17 大肠杆菌质粒提取 |
| 3.2.18 农杆菌感受态EH105的制备 |
| 3.2.19 农杆菌电激转化 |
| 3.2.20 农杆菌介导水稻成熟胚的转化 |
| 3.2.21 水稻原生质体的提取与转化 |
| 3.2.22 温度处理实验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 wgl5突变体的表型分析 |
| 3.3.2 wgl5突变体叶绿素和光合速率测定 |
| 3.3.3 wgl5突变体温度处理 |
| 3.3.4 wgl5突变体分蘖期叶片的透射电镜观察 |
| 3.3.5 wgl5 突变体分蘖期叶片的NBT和 DAB染色 |
| 3.3.6 wgl5突变体分蘖期细胞凋亡分析 |
| 3.3.7 wgl5突变体遗传分析和图位克隆 |
| 3.3.8 wgl5突变体候选基因预测及测序分析 |
| 3.3.9 WGL5基因的转基因互补验证 |
| 3.3.10 WGL5基因的转基因过表达验证 |
| 3.3.11 WGL5蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.12 WGL5表达模式分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 全文结论 |
| 4.1 ES2/OsIPK2 基因的突变导致水稻早衰 |
| 4.2 WGL5/OsDXS1 基因的突变导致叶片出现温敏现象 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
参考文献
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| [3] VOCs和异臭味降解剂ES2的制备及其在橡胶制品中的应用[J]. 世界橡胶工业 2017(09) |
| [4] 基于Madymo的WorldSID与ES2假人性能比较[J]. 佳木斯大学学报(自然科学版) 2013(06) |
| [5] 东濮桥口油田ES2下多油层非均质复杂断块油藏持续稳产对策[J]. 内蒙古石油化工 2012(12) |
| [6] 哌立福辛联合顺铂对卵巢透明细胞癌ES2细胞系凋亡及Caspase-3和PARP表达的影响[J]. 现代妇产科进展 2015(10) |
| [7] 雌二醇对卵巢透明细胞癌ES2细胞增殖的影响及机制探讨[J]. 河北医科大学学报 2019(09) |
| [8] DaWB地区Es2段南部缓坡带三角洲前缘沉积微相研究[J]. 内江科技 2014(03) |
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