人参（Panax ginseng C.A.Meyer）为五加科人参属多年生草本植物,是我国名贵传统的中草药,被广泛应用于保健和医疗行业。人参的主要功能活性成分为人参皂苷,其中含量较多的人参固有皂苷经水解后,失去部分糖基配体得到含量极少具有更强生物活性的人参稀有皂苷,但是由于人参稀有皂苷在自然界中含量极低,使其在开发与应用方面受到了限制。麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座以及幼虫尸体的复合体被称为虫草,其在生长繁殖过程中会产生多种酶类;利用虫草菌所产的糖苷酶可以将固有人参皂苷进行生物转化,得到含有稀有人参皂苷、虫草素和虫草酸等具有双重药效成分的菌质产物。本课题采用超声辅助复合酶法提取人参总皂苷,并经分离纯化后得到人参皂苷Rb1,Rg1与Re单体,研究使用经筛选得到的虫草菌制备稀有人参皂苷的转化路径及转化率,并通过高脂斑马鱼模型筛选具有降脂作用的人参皂苷,探讨人参皂苷Rb1和Rg3的降脂作用及其可能的分子机制。主要内容如下:（1）采用超声辅助复合酶法提取人参总皂苷,在单因素试验结果的基础上,采用响应面分析法中的Box-behnken设计优化最佳工艺,结果为:纤维素酶添加量0.20%,果胶酶添加量为0.25%,料液比为1:20（g/m L）,超声时间为25 min,酶解温度为45℃,酶解p H为5,酶解时间为54.2 min,超声功率为500 W,人参总皂苷的提取率为4.53±0.03%。通过大孔吸附树脂和硅胶层析分离纯化得到人参皂苷单体Rb1,Rg1和Re。利用薄层层析（TLC）、红外光谱分析与高效液相色谱（HPLC）法对三种人参皂苷测定,结果表明纯度均为95%以上。（2）采用对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（p NPG）法,对在长白山原始森林中采集的性状稳定的野生虫草真菌标本菌株进行筛选与鉴定,得到Isaria fumosorosea ZZ和Cordyceps sinensis Y3两株菌种。通过研究在不同条件下菌种产β-葡萄糖苷酶与虫草酸的规律,确定菌株ZZ产酶最优碳源是纤维二糖,氮源是玉米浆粉,培养基初始p H为8;菌株Y3产酶最优碳源是纤维二糖,氮源是牛肉膏,培养基初始p H为8。利用基于串联质量标签标记技术（TMT）的定量蛋白质组学方法,进行Isaria fumosorosea ZZ纤维二糖与蔗糖蛋白质组学数据分析,结果为:共筛选出519个差异蛋白（p<1.5）,上调205个,下调314个。差异蛋白中与生物加工过程相关的主要是“细胞代谢过程”和“有机物代谢过程”,其次是“初级代谢过程”和“氮化合物代谢过程”。在细胞成分分类中,与“细胞内细胞器”和“膜界细胞器”有关的蛋白质的数量占据了前几位。差异蛋白中最丰富的蛋白质主要属于“有机环化合物与杂环化合物结合”和“水解酶和转移酶活性”类,说明纤维二糖不仅影响了碳水化合物、氨基酸和脂类代谢的相关蛋白表达,还影响了遗传信息的翻译后修饰、能量代谢等过程。共鉴定出60个糖苷酶相关蛋白,其中差异表达30个（上调4个,下调26个）。分析结果表明,在纤维二糖存在的情况下,β-葡萄糖苷酶与几丁质酶的产生并没有受到抑制,而其它的糖苷酶的产生则受到抑制。（3）通过UPLC-MS方法研究菌株ZZ与Y3转化人参皂苷Rb1、Rg1和Re的路径。结果表明ZZ与Y3转化Rb1的路径为Rb1→Rd→Rg3及Rb1→Rd→F2→CK。转化Rg1路径为Rg1→Rh1。通过HPLC测定人参皂苷含量计算转化率,ZZ经过192 h发酵后,Rb1转化为Rd的转化率为46.93%,F2 45.71%,CK 53.07%,Rg3 21.98%。Y3经过192h发酵后,转化Rb1的转化率为F2 87.48%,CK 17.34%,Rg3 21.58%。ZZ经过192 h发酵后,Rg1转化为Rh1的转化率为37.15%。Y3经过192 h转化Rg1的转化率为Rh136.42%。两株菌种ZZ与Y3均未发现对人参皂苷Re有转化作用。（4）利用斑马鱼幼鱼高胆固醇动物模型筛选具有降脂作用的人参皂苷。斑马鱼5 dpf（days post fertilization）幼鱼投喂含有荧光探针的12种人参皂苷饲料,连续喂养12 d后,荧光倒置显微镜观察整体与局部躯干的胆固醇积累,计算相对荧光密度及存活率。结果表明人参皂苷Rg3、PPD、Re、Rh2、Rb1和Rg1具有一定的降脂作用。局部躯干降脂比率Re为7.54%,Rh2为1.11%,Rb1为14.22%,Rg1为2.60%。采用斑马鱼成鱼高脂模型,并给予剂量为25、50和100μg/kg的Rb1与Rg3的饲料,投喂40 d后,与对照组相比,Rb1与Rg3药物组降低了斑马鱼血液的TC和TG水平。同时利用苏木精-伊红（HE）与油红O染色对各剂量组的肝脏进行组织病理学检验,证实了Rb1与Rg3的降脂作用。通过Real Time-PCR技术检测相关的关键基因,结果表明,Rb1处理剂量依赖性的下调了HMGCR、LDLR与MTP m RNA的表达,LXRα、ABCG1、NPC1L1、CYP7A1 m RNA的表达量有不同程度的上调。而Rg3处理上调了LXRα、SREBP2ABCG1、NPC1L1和CYP7A1m RNA表达,下调了HMGCR、LDLR m RNA水平。从而推测降脂机制可能与上调胆固醇转运和胆汁酸合成以及抑制胆固醇合成和脂蛋白组装或分泌有关。
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