凝结芽孢杆菌LT3的益生菌性质及其对LPS诱导的盲肠损伤的保护作用

目前,抗生素的滥用产生了一系列安全问题,如一些细菌对抗生素产生耐药性,以及药物残留问题,这些都会直接或间接影响人体健康。因此控制饲料中的抗生素使用,越来越重视起来。抗生素替代品应该具备对动物本身、动物产品无毒害影响,在体内无残留或残留短期,在动物肠道环境不发生分解和变性,不诱发耐药性,在饲料中稳定性好,适口性好,能提高动物抗病能力等益生作用。而益生菌不仅具有上述优势,还具有平衡肠道菌群能力和保护肠道屏障能力。成为当之无愧的抗生素替代品之一。本研究旨在分离鉴定潜在的、具有良好益生特性的凝结芽孢杆菌,并进行动物试验,评估益生菌株对动物肠道的保护作用效果以及机制,为今后凝结芽孢杆菌分离株在生产实践中的应用奠定基础。试验一:凝结芽孢杆菌分离鉴定及益生特性的研究通过菌落特征、革兰氏染色、16S r RNA基因序列测序和同源性分析进行分离株的鉴定。系统研究了分离株对胆盐、酸、盐的耐受性及对病原菌的拮抗作用等益生特性。通过SOD活力和清除羟自由基、DPPH、ABTS能力以及过氧化氢耐受等试验研究该菌株体外抗氧化能力及对抗生素敏感试验测试安全性。结果表明:所分离纯化的菌株为凝结芽孢杆菌,命名为凝结芽孢杆菌LT3。凝结芽孢杆菌LT3具有一定的酸碱盐耐受性,可生长于0.2%的胆盐环境、p H值为2.0的酸性环境、8.5%的盐环境;LT3菌株对大肠杆菌、镰刀菌、志贺氏菌和黄曲霉、沙门氏菌等,都有极好的抑制作用;该菌株对羟自由基、DPPH、ABTS均有很强的清除能力,分别为83.3%、86.0%、93.7%;该菌株还具有很高的SOD活力,为46.0%;在浓度为0.4m M、0.7m M、1.0m M过氧化氢的培养基中,其存活率分别为86.0%、87.0%、84.0%。此外该菌株对七种抗生素阿莫西林（AMX）、丁胺卡那霉素（J）、四环素（TE）、利福平（利）、环丙沙星（环）和红霉素（E）均敏感（S）,对氯霉素（C30）为中介（I）,均不具有耐药性,可认为是安全的。我们分离鉴定的凝结芽孢杆菌LT3不仅具有很好的耐受特性,还具有良好的抗氧化特性及安全性,具有潜在的饲料和食品行业的开发利用价值。试验二:凝结芽孢杆菌LT3对LPS诱导的大鼠盲肠损伤的保护作用将32只雄性Wistar大鼠随机分为4组,分别为CON（对照）组（正常饲喂）、LPS（脂多糖）组（正常饲喂）、HBC组（灌胃1.2×108CFU/m L凝结芽孢杆菌LT3菌液）、LBC组（灌胃1.2×103CFU/m L的凝结芽孢杆菌LT3菌液）,共14d。第15d,将LPS组、HBC组、LBC组每只大鼠注射1mg/kg体重的LPS。4h后麻醉处死大鼠。试验结束后试剂盒检测大鼠血清生化指标及大鼠盲肠组织的抗氧化指标;HE染色检测大鼠盲肠损伤理情况及阿利新兰染色检测杯状细胞数量情况;并且利用蛋白质印记法（Western Blot）检测NFκB和Nrf2相关信号通路及TJ相关蛋白表达水平的变化;利用高通量测序的方法检测盲肠菌群的情况。结果表明:（1）与LPS组相比,LT3菌株的添加能够显著降低促炎细胞因子白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平（p<0.05）,提高抗炎细胞因子白介素4（IL-4）的水平。（2）LT3菌株能够使LPS诱导的大鼠盲肠组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量显著降低（p<0.01）,使谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和过氧化氢酶（CAT）活性显著升高（p<0.01）。（3）组织学HE染色中可以看出LT3的添加使盲肠组织的肠屏障损伤较LPS组有所改善。阿利新兰染色结果可以看出LT3的添加有效增强了盲肠中杯状细胞的数量。（4）LT3通过调控TLR4/MYD88信号通路和Nrf2信号通路以及TJ相关的蛋白表达,有效改善机体炎症和氧化应激,保护肠道屏障免受损伤。（5）通过16S测序发现LT3对肠道菌群的调控起正相关的作用,增加有益菌的丰度。与对照组相比,LT3提高了肠道阿洛巴氏菌（Allobaculum）、阿克曼菌（Akkermansia Muciniphila）和疣微菌（Verrucomicrobiae）的相对丰度,使梭菌（Clostridia）和肠杆菌（Enterobacteriaceae）数量大幅减少。结论:凝结芽孢杆菌LT3菌株通过调控炎症和氧化信号通路以及肠道菌群对LPS诱导的大鼠盲肠损伤起到保护作用。

基本信息

题目	凝结芽孢杆菌LT3的益生特性及对LPS诱导的大鼠盲肠损伤保护作用的研究
文献类型	硕士论文
作者	王焱
作者单位	沈阳农业大学
导师	龙淼,于秀兰
文献来源	沈阳农业大学
发表年份	2020
学科分类	农业科技
专业分类	畜牧与动物医学
分类号	S816.7
关键词	凝结芽孢杆菌,肠道屏障,肠道菌群
总页数：	77
文件大小：	3680k

论文目录

摘要

Abstract

第一章 绪论

1.1 凝结芽孢杆菌的概况

1.1.1 凝结芽孢杆菌的理化性质和结构

1.2 凝结芽孢杆菌的益生作用

1.2.1 改善肠道菌群结构

1.2.2 促进营养物质的消化吸收

1.2.3 免疫调节功能

1.3 凝结芽孢杆菌在动物生产发展中的作用

1.3.1 凝结芽孢杆菌对猪的益生作用

1.3.2 凝结芽孢杆菌对家禽的益生作用

1.3.3 凝结芽孢杆菌对其他动物的益生作用

1.4 本研究的目的与意义

第二章 凝结芽孢杆菌分离鉴定及益生特性的研究

2.1 试验材料

2.1.1 菌种来源

2.1.2 试验试剂

2.1.3 主要仪器及设备

2.2 试验方法

2.2.1 菌株的分离与纯化

2.2.2 菌株的形态学观察

2.2.3 菌株的分子学鉴定

2.2.4 菌株的生物学特征

2.2.5 菌株的益生特性

2.3 结果与分析

2.3.1 菌株的形态学结果

2.3.2 16SrRNA测定及同源性分析结果

2.3.3 菌株的生长曲线

2.3.4 酸耐受试验结果

2.3.5 胆盐耐受试验结果

2.3.6 盐耐受试验结果

2.3.7 抑菌试验结果

2.3.8 清除羟自由基能力试验结果

2.3.9 清除DPPH自由基能力试验结果

2.3.10 清除ABTS自由基能力试验结果

2.3.11 SOD活性试验结果

2.3.12 过氧化氢耐受试验结果

2.3.13 抗生素敏感性试验结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 凝结芽孢杆菌LT3通过调控炎症和氧化信号通路以及肠道菌群减轻LPS诱导的盲肠损伤

3.1 材料

3.1.1 主要试验仪器

3.1.2 主要药品及试剂

3.2 试验方法

3.2.1 试验设计

3.2.2 酶联免疫吸附测定（ELISA）

3.2.3 抗氧化应激指数

3.2.4 组织学评估

3.2.5 蛋白质印迹分析

3.2.6 肠道菌群分析

3.2.7 数据统计与分析

3.3 试验结果

3.3.1 大鼠血清IL-6、IL-4、IL-1β和TNF-α的检测结果

3.3.2 大鼠盲肠组织抗氧化标志物检测结果

3.3.3 大鼠盲肠HE染色结果

3.3.4 大鼠盲肠阿利新兰染色结果

3.3.5 大鼠盲肠组织抗氧化损伤相关蛋白表达水平

3.3.6 大鼠盲肠组织炎症相关蛋白表达水平

3.3.7 大鼠盲肠组织TJ相关蛋白表达水平

3.3.8 大鼠盲肠内容物测序质量评估结果

3.3.9 OTU个数分析

3.3.10 香浓曲线的分析

3.3.11 等级丰度曲线分析结果

3.3.12 α多样性指数分析结果

3.3.13 物种分布柱状图

3.3.14 PCA的分析结果

3.3.15 PCoA的分析结果

3.3.16 组间差异显著性分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

结论

参考文献

附录

致谢

参考文献

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