布鲁氏菌A9疫苗株核酸鉴定序列分析及鉴别诊断方法的建立

背景:布鲁氏菌病是一种严重危害人类健康的细菌性人兽共患病。该病菌至今已有90多年的历程,可在世界大范围流行。易感染哺乳及野生动物,可严重侵袭动物的生殖脏器,病理表现为妊娠母畜的流产及关节肿大、跛行、睾丸炎等。临床症状复杂性高,诊断难度较高,防控手段以接种弱毒疫苗为主,我国常用的疫苗为A19、S2等减毒活疫苗,但依然存在疫苗毒性偏高、缺少区别野毒感染与自然感染的缺点。目前,分子生物学检测应用是热门方向,本实验旨在建立A19疫苗株的分子生物学鉴别诊断方法。目的:建立A19疫苗株的分子生物学鉴别诊断方法。以便建立的方法应用于布鲁氏菌病的相关检测和布鲁氏菌A19疫苗株与其他疫苗株、野毒株的区分。方法:1.使用分析软件Mauve对A19疫苗株的全基因序列与2308野毒株序列进行分析比对,找出差异序列后,使用NCBI网站的BLAST功能与其他疫苗株进行分析比对,找到差异序列,其中均存在差异的序列片段即可成为布鲁氏菌A19疫苗株检测方法建立的有效标识序列。2.通过对布鲁氏菌A19疫苗株与其他疫苗株、野毒株的基因序列对比筛选,并根据筛选出的标识序列进行引物和探针的设计合成。用布鲁氏菌A19疫苗株、其他疫苗株及野毒株核酸胶回收产物作为模板,建立A19疫苗株聚合酶链式反应(PCR)检测方法,进行检测方法的退火温度的条件优化,特异性及灵敏度试验,再使用建立的PCR检测方法与布鲁氏菌Bruce Ladder方法对提取DNA的临床样品进行对比验证。3.建立A19疫苗株双重实时定量荧光反应(q PCR)检测方法,进行检测方法的退火温度的条件优化,特异性及灵敏度试验,再使用建立的q PCR检测方法与布鲁氏菌Bruce Ladder方法对提取DNA的临床样品进行对比验证。结果:1.通过Mavue软件对比分析筛选,查找到布鲁氏菌A19疫苗株特有的缺失片段,并根据筛选的差异序列设计合成布鲁氏菌A19疫苗株PCR引物和双重荧光定量PCR引物及探针引物。2.经过对布鲁氏菌A19疫苗株PCR检测方法的退火温度条件优化,确定A19疫苗株PCR检测方法退火温度为66℃,建立的A19疫苗株PCR检测方法特异性良好,只对A19疫苗株产生特异性扩增,PCR检测方法的灵敏度为3×10~2Copies每反应。3.经过对布鲁氏菌A19疫苗株q PCR检测方法的退火温度条件优化,确定A19疫苗株q PCR检测方法退火温度为68℃,建立的A19疫苗株q PCR检测方法特异性良好,只对A19疫苗株产生特异性扩增,q PCR检测方法的灵敏度为30Copies每反应。结论:成功建立了布鲁氏菌A19疫苗株的分子生物学检测方法,可用于布鲁氏菌A19疫苗株的鉴别诊断。意义:建立的检测方法能够用于检测由于布鲁氏菌A19疫苗株干扰影响的布鲁氏菌病的检测,有效区分A19疫苗株与其他疫苗株、野毒株。节省时间、试剂与费用,从而提高布鲁氏菌病检测的准确性与可靠性。有望在提高检测布鲁氏菌病的效率中发挥至关重要的作用,能够及时发现病菌,趁早采取预防治疗措施,从根源处制止疫情迅猛发展,减轻不必要的经济损失和社会安全危害。

基本信息

题目	布鲁氏菌A19疫苗株核酸标识序列分析及鉴别诊断方法建立的研究
文献类型	硕士论文
作者	杨博涵
作者单位	沈阳农业大学
导师	尹荣焕,刘宝山
文献来源	沈阳农业大学
发表年份	2020
学科分类	农业科技
专业分类	畜牧与动物医学
基金	国家重点研发计划:牛羊重要人畜共患病新型疫苗研究(2017YFD0500901)
分类号	S859.797
关键词	布鲁氏菌病,布鲁氏菌疫苗株,实时荧光定量
总页数：	66
文件大小：	3278k

论文目录

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1.1 简述

1.2 布鲁氏菌的危害性

1.2.1 对动物的危害

1.2.2 对人类的危害

1.3 布鲁氏菌的病原学

1.3.1 布鲁氏菌的形态及染色特性

1.3.2 布鲁氏菌的培养及生化特性

1.3.3 布鲁氏菌的致病力及抵抗力

1.4 布鲁氏菌的流行病学

1.4.1 布鲁氏菌的传染源

1.4.2 布鲁氏菌的传播途径

1.4.3 布鲁氏菌的易感动物

1.5 布鲁氏菌的致病机理

1.6 布鲁氏菌的临床症状及病理变化

1.7 布鲁氏菌的防治措施

1.7.1 布鲁氏菌的防控手段

1.7.2 布鲁氏菌的预防治疗

1.8 布鲁氏菌的诊断方法

1.8.1 细菌学检测

1.8.2 血清学检测

1.8.3 分子生物学检测

1.9 研究的目的与意义

第二章 布鲁氏菌A19疫苗株核酸标识序列分析

2.1 所用软件及数据

2.1.1 全基因组序列

2.1.2 基因对比分析软件（Mauve）

2.1.3 数据分析对比

2.2 方法

2.2.1 数据准备

2.2.2 序列分析

2.2.3 数据整理

2.2.4 特异性比对

2.3 结果与分析

2.3.1 Mauve软件比对结果

2.3.2 BLAST结果分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 A19疫苗株PCR检测方法的建立

3.1 材料

3.1.1 布鲁氏菌标准血清

3.1.2 布鲁氏菌疫苗株的灭活样本

3.1.3 布鲁氏菌2308参考株灭活样本

3.1.4 特异性试验菌株DNA

3.1.5 血液和血清样本

3.1.6 主要试剂名称及厂家

3.1.7 溶液配制

3.1.8 主要使用仪器名称及厂家

3.2 实验方法

3.2.1 引物的设计与合成

3.2.2 虎红平板凝集试验（RBPT）

3.2.3 疫苗株与临床检测样品DNA提取

3.2.4 临床检测样品Bruce Ladder PCR扩增验证

3.2.5 布鲁氏菌A19疫苗株PCR检测方法的建立

3.3 结果与分析

3.3.1 设计合成的引物

3.3.2 虎红平板凝集试验（RBPT）

3.3.3 布鲁氏菌A19疫苗株PCR检测方法退火温度条件优化

3.3.4 布鲁氏菌A19疫苗株PCR检测方法特异性试验

3.3.5 布鲁氏菌A19疫苗株PCR检测方法灵敏度试验

3.3.6 临床检测样品Bruce Ladder PCR扩增验证

3.3.7 布鲁氏菌A19疫苗株PCR检测方法临床样品检测

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 布鲁氏菌A19疫苗株双重荧光定量PCR检测方法的建立

4.1 材料

4.1.1 主要器材

4.1.2 试剂

4.2 方法

4.2.1 布鲁氏菌A19疫苗株双重荧光定量PCR检测反应条件优化

4.2.2 布鲁氏菌 A19 疫苗株双重荧光定量 PCR 检测特异性试验

4.2.3 布鲁氏菌A19疫苗株双重荧光定量PCR检测灵敏度试验

4.2.4 布鲁氏菌A19疫苗株双重荧光定量PCR检测对临床样品试验

4.3 结果与分析

4.3.1 设计合成的引物

4.3.2 布鲁氏菌 A19 疫苗株双重荧光定量 PCR 检测退火温度条件优化

4.3.3 布鲁氏菌 A19 疫苗株双重荧光定量 PCR 检测特异性试验

4.3.4 布鲁氏菌 A19 疫苗株双重荧光定量 PCR 检测灵敏度试验

4.3.5 双重荧光定量 PCR 检测方法重复性分析结果

4.3.6 布鲁氏菌 A19 疫苗株双重荧光定量 PCR 检测临床样品试验

4.4 讨论

4.5 小结

结论

参考文献

致谢

附录

参考文献

[1] 布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统对树突状细胞自噬、胞内生存和炎症反应的影响[J]. 中国畜牧兽医 2021(01)

[2] 布鲁氏菌致动物繁殖障碍的研究进展[J]. 中国兽医杂志 2020(09)

[3] 犬种布鲁氏菌的遗传多样性分析[J]. 微生物学通报 2019(12)

[4] 基于比较基因组学方法的世界范围的犬布鲁氏菌系统发育群研究[J]. 中国生物工程杂志 2020(03)

[5] 羊布鲁氏菌致肩关节感染1例报道[J]. 中国骨与关节损伤杂志 2020(05)

[6] 2018年江苏省人感染布鲁氏菌分离株分子特征分析[J]. 中国人兽共患病学报 2020(07)

[7] 宁夏布鲁氏菌系统鉴定及16SrRNA基因序列分析[J]. 宁夏医学杂志 2020(07)

[8] 布鲁氏菌对孕妇健康影响的血清流行病学调查与个案报道[J]. 中国地方病防治 2020(05)

[9] 双精氨酸转运系统是布鲁氏菌重要的抗胁迫和毒力决定因子[J]. 中国预防兽医学报 2020(10)

[10] 不同方法检测布鲁氏菌抗体的对比评价[J]. 中国实用医药 2019(07)

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[14] 近十年布鲁氏菌研究论文发表情况定量分析[J]. 西南民族大学学报(自然科学版) 2019(05)

[15] 布鲁氏菌新型检测技术研究进展[J]. 家畜生态学报 2019(08)

[16] 西藏地区首例血培养分离布鲁氏菌[J]. 中国人兽共患病学报 2019(09)

[17] 陕西省2018年布鲁氏菌种型鉴定方法的比较分析[J]. 医学动物防制 2019(12)

[18] 非牧区跳跃性布鲁氏菌性脊柱炎1例并文献复习[J]. 颈腰痛杂志 2016(02)

[19] 布鲁氏菌毒力因子研究进展[J]. 微生物学通报 2021(03)

[20] 血培养检出马耳他布鲁氏菌2例病例报告[J]. 中国冶金工业医学杂志 2021(01)

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[23] 广东省羊种布鲁氏菌的多位点序列分型研究[J]. 华南预防医学 2016(05)

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[29] 浙江省桐乡市首例布鲁氏菌病原学诊断病例调查[J]. 疾病监测 2013(01)

[30] 辽宁省1株犬种布鲁氏菌分离株的分子生物学鉴定[J]. 疾病监测 2012(05)

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