非洲猪瘟病毒pS273R重组蛋白的表达及小分子抑制剂E-64对其酶活性影响的初步评价

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus,ASFV）感染引起的危害养猪业的重大动物疫病,该病在急性期表现出不同的临床症状,病死率高达100%,迄今为止依然没有有效的疫苗及治疗方案。ASFV pS273R蛋白是一种特殊的SUMO-1样半胱氨酸蛋白酶,具有高度的保守性,能够将ASFV p P220和p P62蛋白分解成多个成熟的衣壳蛋白,参与病毒粒子核衣壳的组装,在ASFV复制过程中发挥重要作用。因此筛选能够抑制ASFV pS273R蛋白酶活性的药物,抑制ASFV核衣壳的组装,形成不具有感染性的病毒粒子,对于非洲猪瘟综合防治具有重要意义。本研究首先构建ASFV pS273R蛋白的原核与真核表达载体,通过Modeller 9.20软件对ASFV Georgia 2007/1株pS273R蛋白的晶体结构进行预测分析,再结合Inter Pro网站的数据筛选出针对pS273R蛋白的小分子靶向抑制剂。通过小分子抑制剂和pS273R蛋白进行分子对接、共价对接和体外验证实验综合评价小分子抑制剂对pS273R蛋白酶活性中心靶向抑制的特点。SDS-PAGE和Western Blot实验鉴定结果显示成功表达了ASFV pS273R重组蛋白。筛选出的小分子抑制剂E-64的14号碳原子可与pS273R蛋白残基CYS232形成稳定的C-S共价键,还同时形成7个氢键作为辅助结合。将重组载体Flag-pS273R和重组载体HA-p P62共转染进293T细胞,在不同浓度的E-64抑制剂作用下,利用Western Blot技术检测小分子抑制剂E-64对ASFV pS273R蛋白酶活性的抑制效果,结果显示4 m M浓度的E-64抑制剂能够抑制pS273R蛋白酶活性,并且添加4 m M E-64抑制剂后的细胞形态规则无过量死亡细胞,细胞活力为101.86%,表明4 m M E-64抑制剂不会对293T细胞造成细胞毒性。荧光定量PCR检测结果显示ASFV pS273R蛋白转染293T细胞后能够下调细胞免疫因子IFN-γ和IL-12的m RNA转录水平,与转染空白载体相比差异极显著（P<0.01）;添加4 m M E-64抑制剂能够上调细胞免疫因子IL-12、IFN-γ和IFN-α的m RNA转录水平,与转染ASFV pS273R蛋白相比IL-12差异极显著（P<0.01）,IFN-γ和IFN-α差异显著（P<0.05）。综上所述,小分子抑制剂E-64能够从细胞水平抑制ASFV pS273R活性,并且不影响细胞的生物学活性。本研究为非洲猪瘟药物开发提供新思路,为全面了解ASFV pS273R蛋白的结构功能和药物靶标的筛选提供理论基础。

基本信息

题目	非洲猪瘟病毒pS273R重组蛋白的表达与小分子抑制剂E-64对其酶活性影响的初步评价
文献类型	硕士论文
作者	刘邦佐
作者单位	沈阳农业大学
导师	刘金玲,魏澍
文献来源	沈阳农业大学
发表年份	2020
学科分类	基础科学,农业科技
专业分类	生物学,畜牧与动物医学
分类号	S852.651
关键词	非洲猪瘟病毒,重组蛋白,分子对接,抑制剂
总页数：	71
文件大小：	2971k

论文目录

摘要

ABSTRACT

主要英文缩略语索引

第一章 引言

1.1 非洲猪瘟概述

1.1.1 分子病原学

1.1.2 流行病学

1.2 非洲猪瘟药物研究进展

1.2.1 非洲猪瘟潜在药物研究

1.2.2 小分子抑制剂

1.2.3 同源建模与分子对接

1.3 研究目的与意义

第二章 ASFV pS273R重组蛋白的表达

2.1 材料

2.1.1 试剂与耗材

2.1.2 主要仪器与设备

2.1.3 模板和引物

2.1.4 质粒和细胞

2.1.5 试剂配制

2.2 方法

2.2.1 PCR扩增反应

2.2.2 PCR产物胶回收纯化

2.2.3 目的基因与质粒双酶切

2.2.4 重组载体的构建

2.2.5 转化大肠杆菌

2.2.6 重组阳性菌落的筛选

2.2.7 重组载体双酶切及基因测序鉴定

2.2.8 重组蛋白的表达

2.2.9 重组蛋白His-pS273R纯化

2.3 结果

2.3.1 重组蛋白His-pS273R的表达

2.3.2 重组蛋白Flag-pS273R的表达

2.3.3 重组蛋白HA-pP62的表达

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 ASFV pS273R蛋白三级结构预测与抑制剂筛选

3.1 材料

3.2 方法

3.2.1 pS273R蛋白三级结构预测

3.2.2 潜在抑制剂与pS273R蛋白分子对接

3.2.3 小分子抑制剂E-64与pS273R蛋白共价对接

3.3 结果

3.3.1 pS273R蛋白三级结构预测

3.3.2 潜在抑制剂与pS273R蛋白分子对接

3.3.3 E-64抑制剂与pS273R蛋白共价对接

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 ASFV pS273R蛋白酶活性抑制实验

4.1 材料

4.1.1 试剂与耗材

4.1.2 主要仪器与设备

4.1.3 试剂配制

4.1.4 引物设计

4.2 方法

4.2.1 重组蛋白Flag-pS273R与 HA-p P62 共转染

4.2.2 不同浓度的E-64抑制pS273R蛋白酶活性的检测

4.2.3 CCK-8实验检测细胞毒性

4.2.4 细胞免疫因子的荧光定量检测

4.2.4.1 提取细胞RNA并反转录成c DNA

4.2.4.2 荧光定量PCR

4.3 结果

4.3.1 重组蛋白Flag-pS273R与 HA-p P62 相互作用

4.3.2 抑制剂E-64对pS273R蛋白酶活性抑制的结果

4.3.3 抑制剂E-64对细胞活性的影响

4.3.4 抑制剂E-64对IFN-γ、IL-12、IL-4、IFN-αm RNA转录水平的影响

4.4 讨论

4.5 小结

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的文章

参考文献

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