特应性皮炎是一种具有炎症性、瘙痒性以及高复发性的常见慢性皮肤病,其在全球的发病率逐年上升。临床上用于治疗特应性皮炎的药物如糖皮质激素等疗效显著,但也存在较多严重的不良反应。玉屏风散作为经典名方,具有益气固表之功效,在治疗过敏性疾病中的疗效显著。本课题组前期研究发现,玉屏风散及其效应成分如芒柄花素等可有效缓解FITC诱导的特应性皮炎模型小鼠的症状,其机制与调节上皮细胞功能有关,可显著抑制上皮细胞分泌促过敏关键启动因子TSLP。这与玉屏风散的益气固表功效相吻合,但其具体调控机制尚不清楚,亟待进一步研究。本课题组前期应用基因芯片分析了特应性皮炎小鼠模型中的基因变化,从中筛选发现A20及TSLP基因在模型组内表达变化明显,且目前的研究也表明A20可作为NF-κB的关键负调控因子参与过敏性疾病的产生。那么A20是否与上皮细胞分泌的TSLP有关系呢?玉屏风散效应成分芒柄花素等对A20又是否具有调控作用呢?为了回答以上问题,本文主要从以下几个方面进行研究:一、A20与TSLP的相关性及机制探讨体外使用TNF-α和Poly（I:C）不同时间点联合刺激HaCaT细胞,或在HaCaT细胞中过表达和干扰A20,检测A20对TSLP蛋白（ELISA）和mRNA（qPCR）表达的影响。结果表明:1.A20、TSLP蛋白和mRNA在HaCaT细胞中的表达呈现此消彼长的动态变化,表明二者存在相关性;2.过表达A20显著抑制TSLP蛋白和mRNA的表达,反之干扰A20则使TSLP蛋白和mRNA的表达显著上调;3.过表达不同浓度A20可呈剂量依赖性抑制TSLP的表达。以上结果提示A20可负调控TSLP的表达。在HaCaT中过表达A20全长、N端和C端蛋白,检测A20不同结构区域对TSLP蛋白表达的影响;免疫沉淀反应检测TSLP与Ub的结合情况;GeneCards、Alggen和ChiPBase软件预测TSLP的转录因子;TNF-α和Poly（I:C）联合刺激HaCaT细胞或使用siRNA干扰A20 的表达,检测 NF-κB p65、STAT1、STAT3 和 STAT6 蛋白的表达（Western blotting）;分别加入各转录因子的抑制剂,观察对TSLP蛋白表达的影响。结果表明:1.过表达全长和C端A20蛋白可显著抑制TSLP的表达,而N端对TSLP表达未见明显影响;2.TSLP不能被Ub修饰;3.TNF-α和Poly（I:C）联合刺激可促进HaCaT中p-STAT1、p-STAT3和p-STAT6的表达;4.干扰A20后,p-STAT1和p-STAT3的表达显著增加,而对p-STAT6的表达未见明显影响,表明A20可负调控p-STAT1和p-STAT3的表达;5.NF-κB p65抑制剂PDTC、STAT1抑制剂Fludarabine和STAT3抑制剂Stattic均可显著抑制TSLP的表达。以上结果提示,A20通过其蛋白质的C端（泛素化活性端）发挥负调控TSLP的作用,该作用与抑制p-NF-κB p65、p-STAT1和p-STAT3的表达有关。在HaCaT细胞中给予蛋白合成抑制剂CHX,检测STAT1和STAT3的表达;体外过表达A20,检测STAT1和STAT3的表达;体外过表达A20,并给予蛋白酶体抑制剂MG132和自噬酶体抑制剂Chloroquine,检测STAT1的表达;免疫沉淀反应检测STAT1及STAT3分别与Ub、K48和K63链的结合情况;在HaCaT过表达和干扰A20,检测A20对K48和K63链的影响。结果表明:1.给予CHX后STAT1和STAT3的表达显著降低,表明STATI和STAT3可发生降解;2.过表达A20可显著抑制p-STAT1和p-STAT3的表达;3.过表达A20可显著下调STAT1的表达,且MG132可拮抗该作用,而Chloroquine未见明显影响,提示A20通过蛋白酶体途径调节STAT1的表达;4.STAT1和STAT3均可与Ub、K48和K63链结合;5.过表达A20显著上调K48链的表达,干扰A20则显著抑制K48链的表达,而对K63链未见明显影响,表明A20在HaCaT细胞中主要影响K48链的表达。以上结果提示A20对TSLP的负调控作用与其促进K48链依赖的STAT1和STAT3的泛素化有关。二、玉屏风散效应成分通过调节A20影响HaCaT细胞中TSLP的表达在HaCaT细胞中给予玉屏风散活性成分黄芪甲苷、升麻素、毛蕊异黄酮和芒柄花素,考察其对TSLP和A20及其下游信号通路的影响;体外在HaCaT细胞或体内在AD致敏初期模型上给予芒柄花素,检测芒柄花素对TSLP和A20及其下游信号通路的影响;在HaCaT细胞中干扰A20,给予芒柄花素,检测干扰A20后芒柄花素对TSLP和A20及其下游信号通路的影响。结果表明:1.玉屏风散活性成分可不同程度上调A20的表达、抑制p-NF-κB p65、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT6的表达、下调TSLP的产生,其中芒柄花素作用最强;2.进一步体内和体外研究均显示,芒柄花素可显著上调A20蛋白和mRNA的表达、抑制p-STAT1和p-STAT3的表达、下调TSLP蛋白和mRNA的表达;3.HaCaT细胞中干扰A20后,芒柄花素对于TSLP的抑制作用则被拮抗。以上结果提示芒柄花素通过上调A20的表达抑制p-STAT1和p-STAT3表达,进而抑制TSLP的产生。三、芒柄花素调控A20的机制探讨在HaCaT细胞中给予不同雌激素受体激动剂或抑制剂,检测其对A20表达的影响;使用分子对接（DS 3.0软件）考察芒柄花素与ER-α、ER-β和GPER的结合情况;在HaCaT细胞中给予GPER激动剂G1或抑制剂G15,或使用siRNA干扰GPER的表达,考察GPER在芒柄花素调控A20中的作用;体内建立FITC诱导的AD致敏初期模型,分别给予G1、G15和芒柄花素,考察芒柄花素缓解AD进程中GPER的作用。结果表明:1.GPER激动剂G1显著上调A20的表达,而ER-α激动剂PPT和ER-β激动剂DPN未见明显影响;GPER抑制剂G15则显著抑制A20的表达,而ER-α抑制剂MPP和ER-β抑制剂PHTPP未见明显影响;2.芒柄花素与GPER的结合能力强于ER-α和ER-β;3.给予GPER抑制剂G15或干扰GPER后,芒柄花素对A20的上调作用被拮抗,且GPER激动剂G1与芒柄花素可协同上调A20的表达;4.G1和芒柄花素可显著上调AD致敏初期模型中A20的表达,抑制TSLP的产生,G15可拮抗芒柄花素对A20和TSLP的作用。以上结果提示芒柄花素通过激活GPER上调A20的表达。研究结论:1.A20通过其蛋白质C端结构负调控TSLP,其作用是通过促进STAT1和STAT3上K48链的形成,促进其泛素化降解,进而抑制TSLP的表达;2.芒柄花素显著抑制FITC诱导的AD致敏初期IgE以及促过敏关键启动因子TSLP的表达,有效缓解特应性皮炎的症状,其机制是通过激活GPER,上调A20的表达,影响STAT1和STAT3的泛素化,进而抑制TSLP的产生。
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